Оптимизация производительности ГПХ, с использованием BI-MwA

Абстракт:

Гель-проникающая хроматография (ГПХ) в сочетании с многоугловым статическим рассеянием света (SLS) - это современный и мощный метод определения абсолютных значений молекулярной массы без необходимости полагаться на традиционную калибровку колонки. В GPC-MALS уровни интенсивности сигнала оцениваются количественно, а не по времени элюирования. Однако, в отличие от обычного метода калибровки колонки по стандартному образцу полимера, для проведения правильных расчетов, нужно очень точно учитывать концентрацию образца и объем впрыска.

Прибор для анализа молекулярной массы методом статического многоуглового светорассеяния – BI-MwA

Введение:

ГПХ является полезным методом для определения молекулярной массы белков, полимеров и многих других наноматериалов. Однако его полезность ограничена требованием калибровки колонок ГПХ по стандартам известной молекулярной массы ( M _w), который может быть не того же химического состава, что и неизвестный образец. Механизм разделения является в основном гидродинамическим и основан на исключении по размеру. В зависимости от элюента, некоторые образцы могут прилипать к стационарной фазе во время элюирования, что приводит к ошибочным определениям молекулярной массы. Лучшим подходом является оснащение системы ГПХ детектором многоуглового рассеяния света (MALS), обеспечивающим точное определение молекулярной массы без необходимости калибровки колонки. ГПХ фракционирует образец, а детектор MALS анализирует абсолютную M _w.

Анализатор молекулярной массы Brookhaven Instruments (BI-MwA) - это детектор многоуглового статического рассеяния света (MALS), который, при подключении к системе GPC, обычно сочетается с BI-DNDC (дифференциальным рефрактометром). BI-MwA имеет встроенную проточную кювету и волоконно-оптическую систему деления света, которая обеспечивает 7 фиксированных углов обнаружения и позволяет получить угловую зависимость рассеянного света. Типичный эксперимент ГПХ с использованием детектора в указанной выше конфигурации дает хроматограмму с тремя гистограммами: УФ, ИК и LS. УФ-детекция часто не подходит для обнаружения синтетических полимеров, которые, в отличие от образцов белка, часто имеют минимальное или не имеют УФ-поглощение. Гистограмма LS может быть расширена, чтобы показать интенсивность статического светорассеяния с каждого угла отдельно.

Типичный набор хроматограмм, полученных с использованием

BI-MwA и BI-RIVS как части системы ГПХ

Очень простые системы ГПХ состоят из одной колонны, инжектора, насоса и детектора, без каких-либо других принадлежностей. Высококачественные системы ВЭЖХ могут поставляться с несколькими детекторами, автосамплерами, колонными печами и многим другим. В любом случае, наиболее важными компонентами любой системы являются сама колонка ГПХ и детектор. BI-MwA Brookhaven может получать аналоговые сигналы от различных детекторов, которые уже могут быть частью существующей системы ГПХ, чтобы обеспечить дополнительные возможности обнаружения таких параметров, как: вязкость, УФ и ИК. Эти данные могут быть переданы в программное обеспечение ParSEC для получения единой хроматограммы. Программа ParSEC позволяет рассчитать мгновенное значение мекулярного веса в любой точке хроматограммы или среднего молекулярного веса в предварительно выбранном диапазоне.

Экспериментальные вводные

Анализ данных

Есть три варианта для анализа полученных данных. Эти варианты определяются в соответствии с тем, что известно об образце. Обычно есть два возможных параметра, которые могут быть известны заранее, а именно: масса впрыскиваемого вещества и индекс рефракции dn / dc.

Соответственно есть три возможных вводных условия для анализа полученных данных:

Результаты

Мы продемонстрировали важность точного определения концентрации вводимого в колонку образца. Как показано ниже, кажущаяся молекулярная масса (M _w) может резко отличается, даже при незначительных расхождениях в объеме инъекции.

Расчеты с использованием правильного объема впрыска в сравнение с расчетами, проведенными с использованием неправильно оцененных объемов

Пример влияния изменения объема впрыска показан в приведенной выше таблице. Данные собирали с помощью программного обеспечения Brookhaven Instruments ParSEC и анализировали тремя способами. Приведенный в таблице анализ был выполнен для случая, когда концентрация известна, а dn / dc неизвестен. Обратите внимание, что определенная молекулярная масса изменялась примерно на 5%, при расхождении в оценке объема впрыска в 1%. Это иллюстрирует влияние изменения объема впрыска.

В обычном режиме программное обеспечение ParSEC вычисляет абсолютную концентрацию и молекулярную массу как функцию объема элюирования, генерируя графики Цимма (Zimm) на основе уравнения Цимма и экстраполируя данные рассеяния света к нулевому углу. Конечно, прямая экстраполяция до нулевой концентрации невозможна, поскольку данные, зависящие от концентрации, недоступны в этой точке. Но, как и все современные программы GPC/SEC, ParSEC позволяет корректировать второй вириальный коэффициент.

Выводы

MwA Brookhaven - это мощный инструмент, который может значительно увеличить возможности существующей системы ГПХ. Воспроизводимая нагрузка на колонку (объем и концентрация образца) имеет решающее значение для успешного соединения многоуглового статического рассеяния света (MALS) с ГПХ, ЭХ (эксклюзионная хроматография) или любым другим методом хроматографии. Это необходимо, поскольку концентрация является существенной переменной в уравнении Цимма (см. приложение), которое является основой для расчета молекулярной массы.

·         Выбор метода анализа: Если повторяемость инжектора не лучше, чем 2%, то лучше выбрать метод анализа где введенная масса (концентрация и объем впрыска) неизвестна, а известно только значением dn / dc.

·         Цель высокой точности инжектора: При анализе образцов с неизвестными значениями dn / dc (наиболее распространенный случай) повторяемость инжектора должна быть лучше, чем 1%. 

·         Цель высокой точности анализа концентрации образца: При анализе образцов с неизвестными значениями dn / dc (наиболее распространенный случай) концентрация образца должна быть измерена с точностью до 1%. 

Аппендикс

Расчеты параметров рассеяния света

Угловая зависимость рассеянного света используется для измерения размера, R g и молекулярной массы (M w)

При расчете молекулярной массы данные рассеяния света обычно оцениваются с использованием уравнения Цимма:

K c / ΔR = 1 / M _w (1 + ( q ² R _g ² ) / 3) + 2 A ₂ c

Здесь K - константа Дебая, константа системы полимер-растворитель или белок-растворитель. Для вертикально поляризованного света,

K = 4 π ² n ² (dn / dc) ² / (N _a λ ⁴ )

где n - показатель преломления растворителя, N _a - число Авогадро, а λ - длина волны лазера. Концентрация полимера или белка (с) определяется при приготовлении растворов образцов, а ΔR пропорционально избыточной интенсивности рассеяния и измеряется.